1989年12月発売。通称グラスリ。

前作グラディウスIIが大ヒットし、満を持してリリースされたシリーズ4作目。
旧作のステージが再現されていたり、旧作のBGMも隠し曲で聴ける。
ストーリー的にも「バクテリアン」本体を倒すものとなっており、シリーズの区切りにするべく出された作品であることが伺える。

非常に高い難易度が特徴である。また全10ステージ＋隠し面と非常にボリュームが大きい作品で、ノーミスで1周しても約1時間もかかる。
リリース当時は低評価であったが、インターネットの普及後は攻略パターンが広まり、プレイ人口が増えた。
移植はスーパーファミコン向けに行われた。ハード性能の違いからかなりのアレンジが加えられている。これには賛否両論であったが、非常に遊びやすい作品に仕上がっており、SFC用のSTGとしては名作である。
その後完全移植として「グラディウスIII＆IV〜復活の神話〜」が発売された。「グラディウスポータブル」にも収録されている。

またこの作品は、ゲーメストなどでアイディアコンテストが行われた。
入賞者にはグラIIおよび沙羅曼蛇の特別バージョンの基板が副賞として贈られている。

ストーリー

限りなく深い闇の彼方、幾重にも重なる暗黒銀河…。
その未知なる領域より生まれいでし謎の破壊神“バクテリアン”が再び活動を開始はじめた…。
“ダーク・フォース”、“バクテリアン”が自らの野望を達成すべく発動した最後の攻撃である。
“ダーク・フォース”は、我々の想像を絶する強大なパワーを持つエネルギーで全宇宙を包み込む破壊と殺戮の限りを尽くす。
侵略の影はグラディウス周辺の惑星を次々と飲み込み、今まさにグラディウス本星に魔の手を伸ばしつつあった。

グラディウス連邦政府は、この脅威に対処すべくグラディウス全軍を挙げての一大防衛網を敷き、総攻撃に臨んだが、
このかつてないほどの強大なダーク・フォースを前に必死の防衛も破られようとしている。
そして再び超時空ファイター、ビックバイパーが発進。
全宇宙の命運を賭け、果てしない闇の彼方へと今、飛び立つ……。

自機

ビックバイパーMk.III
尾翼の先などのランプが点滅するなど、非常に描き込みが細かい。

パワーアップ　

スピード−ミサイル−ダブル−レーザー−オプション−シールド−！
の7ゲージ式。
以下の4タイプから選ぶか、エディットモードで好きな装備を選択する。
「！」は特殊効果となっており、デフォルト装備ではメガクラッシュ（画面上のザコ敵一掃＋敵弾消去）だが、エディット装備では他の効果も選べる（後述）。

TYPE A

シリーズ伝統の装備。ミサイルは2連射になっている。

• ミサイル
• ダブル
• レーザー

TYPE B

広範囲に攻撃ができる。

• スプレッドボム
• テイルガン
• リップルレーザー

TYPE C

上下方向に強い。

• 2Wayミサイル
• バーチカル
• サイクロンレーザー - 沙羅曼蛇のレーザーのようなグラフィック。ノーマルレーザーより若干攻撃力が低い。

TYPE D

攻撃力が高い。

• フォトントゥーピド
• フリーウェイ
• ツインレーザー

エディット装備

• ミサイル
  • ノーマルミサイル
  • アッパーミサイル
  • コントロールミサイル
  • スモールスプレッド

• ダブル
  • バーチカル
  • スプレッドガン
  • テイルガン
  • フリーウェイ

• レーザー
  • ツインレーザー
  • リップルレーザー
  • エナジーレーザー - 溜め撃ち方式のレーザー
  • サイクロンレーザー

• オプション
  • オプション
  • スネークオプション - 自機を軸にして慣性によって振り回すような形で動くオプション。

• シールド
  • フォースフィールド
  • シールド
  • フリーシールド
  • リデュース - 自機が縮小する。防御力はなく、敵弾などにあたるとすぐミスになる。

• ！
  • ノーマルショット - レーザーなどからノーマルショットに戻す
  • スピードダウン - スピードを0速に戻す
  • リメインオプション - 残機をオプションに変換する。