SARS-CoV-2 mRNAワクチンは、NTD、RBD、S2に対する機能的に多様な抗体を誘導
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kazuchan_withlove 2021年07月24日(土) 15:42:16履歴
SARS-CoV-2 mRNAワクチンは、NTD、RBD、S2に対する機能的に多様な抗体を誘導 
SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2
2021年6月8日 CELL掲載 Fatima Amanat et al
DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.06.005
この翻訳はベースにDeepL翻訳アプリを使い、文体や用語の統一など多少の修正を加えたものです。論文の重要な構成要素である図表も省略しています。英語論文の大意をつかむために簡易的に日本語に変換しただけのものであり、科学的な正確性は検証されていません。参考程度にしていただき、必要時原著をご確認下さい。また翻訳改善のため随時翻訳を更新しますのでご注意ください。
ハイライト
・SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種後の抗体反応は、RBD、NTD、S2を標的とする
・SARS-CoV-2 mRNAのワクチン接種は、高い確率で非中和抗体を誘導する
・季節性βコロナウイルスに対する交差反応性抗体がワクチン接種によって誘導される
・N501Y変異はヒトACE2との親和性を高め、E484Kは親和性を低下させる
サマリー
この研究では、SARS-CoV-2 スパイク mRNA ワクチンを接種した人から、ワクチンによって誘発されるポリクローナル抗体とプラスマブラスト（形質芽細胞）由来の mAbs（モノクローナル抗体） をプロファイリングした。ワクチン接種者のポリクローナル抗体反応は強固で、自然感染後に見られるものと同等かそれ以上であった。
しかし、ワクチン接種後の結合抗体と中和抗体の比率は自然感染のそれよりも大きく、また、モノクローナルレベルでは、ワクチンで誘導された抗体の大半が中和活性を持たないことがわかった。
また、SARS-CoV-2のスパイクのNTDとRBDを標的とするmAbが共優勢であり、季節性ヒトコロナウイルスOC43とHKU1のスパイクに対しては、抗原原罪のようなバックブーストが見られた。
NTDの広範な変化を持ち、E484K変異のある臨床分離株に対する（RBD mAbsではなく）NTD mAbsの中和活性は消失したことから、ワクチンによって誘導されたRBD結合抗体の分量が、E484K単一のRBD変異を有する変異株に対しては実質的な防御力となるということが示唆された。
しかし、ワクチン接種後の結合抗体と中和抗体の比率は自然感染のそれよりも大きく、また、モノクローナルレベルでは、ワクチンで誘導された抗体の大半が中和活性を持たないことがわかった。
また、SARS-CoV-2のスパイクのNTDとRBDを標的とするmAbが共優勢であり、季節性ヒトコロナウイルスOC43とHKU1のスパイクに対しては、抗原原罪のようなバックブーストが見られた。
NTDの広範な変化を持ち、E484K変異のある臨床分離株に対する（RBD mAbsではなく）NTD mAbsの中和活性は消失したことから、ワクチンによって誘導されたRBD結合抗体の分量が、E484K単一のRBD変異を有する変異株に対しては実質的な防御力となるということが示唆された。
はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に対する自然および適応免疫反応の理解は、コロナウイルス2019年疾患（COVID-19）のパンデミックが始まって以来、急速に進展している（Carvalhoら、2021年）。
血清中のウイルスのスパイクタンパク質に対するポリクローナル抗体反応は、その動態、結合能力、および機能性に関してよく特徴づけられている（Grandjeanら、2020年、Ishoら、2020年、Iyerら、2020年、Rippergerら、2020年、Seowら、2020年、Wajnbergら、2020年）。
同様に、SARS-CoV-2感染によって誘導されるプラスマブラスト応答とメモリーB細胞応答の両方について、心強いデータが発表されている（Danら、2021年、Gaeblerら、2020年、Guthmillerら、2021年、Huangら、2021年、Robbianiら、2020年、Roddaら、2021年、Wilsonら、2020年）。
mRNAベースのワクチンを含むSARS-CoV-2ワクチン接種に対する免疫反応は、これらのワクチンが利用可能になったのが2020年の最後の数ヶ月であるため、あまり研究されていない（Badenら、2020年、Polackら、2020年）。
しかし、感染症の結果としてではなく、ワクチン接種によってほとんどの人の免疫を獲得するという目標を考えると、ワクチンによる免疫を理解することは非常に重要である。
SARS-CoV-2スパイクの受容体結合ドメイン（RBD）は、宿主細胞の侵入を媒介する細胞受容体アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）と直接相互作用するため、血清学的およびB細胞研究の重要な標的となる（Letkoら、2020年、Wrappら、2020年）。
RBDに結合する抗体は、ウイルスのACE2への付着を強力にブロックし、それによってウイルスを中和することができる（Barnes et al.、2020）。
その結果、完全長スパイクベースのワクチンに加えて、RBDベースのワクチンが開発されている（Krammer、2020年）。
スパイクに対するB細胞応答の分析は、一般に、RBDおよびRBDベイトで選別された細胞に焦点を当てており、非RBD標的を省略することで固有のバイアスを導入している（Caoら、2020年、Gaeblerら、2020年、Robbianiら、2020年、Weisblumら、2020年）。
これは、ワクチン接種を受けた人から分離されたB細胞およびモノクローナル抗体（mAb）にも当てはまる（Wangら、2021年）。
しかし、スパイクタンパク質内の他のエピトープ、特にN末端ドメイン（NTD）だけでなく、S2も中和エピトープを保持している（Chiら、2020年、Liuら、2020年、McCallumら、2021年、Songら、2020年）。
実際、NTDは、3つの最も顕著なバリアントオブコンサーション（VOC）（B.1.1.7、B.1.351、P.1）で大きく変異している（Daviesら、2021年、Fariaら、2021年、Tegallyら、2020年）。
ここでは、SARS-CoV-2 mRNAベースのワクチン接種に対するバイアスのかかっていないプラスマブラストの反応を研究し、いくつかの新しい発見を報告した。
まず、ウイルスのスパイクタンパク質のB細胞標的として、RBDとNTDが共存していることを明らかにし、NTDの重要性を強調した。
また、ワクチンによって誘導された最初のNTD mAbsも報告しています。さらに、単離されたmAbの大部分は非中和性であることを示し、これは自然感染に比べてワクチン接種後の血清中に見られる高い結合率と中和率を反映している。
最後に、プラズマブラストのデータから、ワクチンによる反応の少なくとも一部は、ヒトβ-コロナウイルスに対する既存の免疫によって偏っていることが示唆された。
血清中のウイルスのスパイクタンパク質に対するポリクローナル抗体反応は、その動態、結合能力、および機能性に関してよく特徴づけられている（Grandjeanら、2020年、Ishoら、2020年、Iyerら、2020年、Rippergerら、2020年、Seowら、2020年、Wajnbergら、2020年）。
同様に、SARS-CoV-2感染によって誘導されるプラスマブラスト応答とメモリーB細胞応答の両方について、心強いデータが発表されている（Danら、2021年、Gaeblerら、2020年、Guthmillerら、2021年、Huangら、2021年、Robbianiら、2020年、Roddaら、2021年、Wilsonら、2020年）。
mRNAベースのワクチンを含むSARS-CoV-2ワクチン接種に対する免疫反応は、これらのワクチンが利用可能になったのが2020年の最後の数ヶ月であるため、あまり研究されていない（Badenら、2020年、Polackら、2020年）。
しかし、感染症の結果としてではなく、ワクチン接種によってほとんどの人の免疫を獲得するという目標を考えると、ワクチンによる免疫を理解することは非常に重要である。
SARS-CoV-2スパイクの受容体結合ドメイン（RBD）は、宿主細胞の侵入を媒介する細胞受容体アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）と直接相互作用するため、血清学的およびB細胞研究の重要な標的となる（Letkoら、2020年、Wrappら、2020年）。
RBDに結合する抗体は、ウイルスのACE2への付着を強力にブロックし、それによってウイルスを中和することができる（Barnes et al.、2020）。
その結果、完全長スパイクベースのワクチンに加えて、RBDベースのワクチンが開発されている（Krammer、2020年）。
スパイクに対するB細胞応答の分析は、一般に、RBDおよびRBDベイトで選別された細胞に焦点を当てており、非RBD標的を省略することで固有のバイアスを導入している（Caoら、2020年、Gaeblerら、2020年、Robbianiら、2020年、Weisblumら、2020年）。
これは、ワクチン接種を受けた人から分離されたB細胞およびモノクローナル抗体（mAb）にも当てはまる（Wangら、2021年）。
しかし、スパイクタンパク質内の他のエピトープ、特にN末端ドメイン（NTD）だけでなく、S2も中和エピトープを保持している（Chiら、2020年、Liuら、2020年、McCallumら、2021年、Songら、2020年）。
実際、NTDは、3つの最も顕著なバリアントオブコンサーション（VOC）（B.1.1.7、B.1.351、P.1）で大きく変異している（Daviesら、2021年、Fariaら、2021年、Tegallyら、2020年）。
ここでは、SARS-CoV-2 mRNAベースのワクチン接種に対するバイアスのかかっていないプラスマブラストの反応を研究し、いくつかの新しい発見を報告した。
まず、ウイルスのスパイクタンパク質のB細胞標的として、RBDとNTDが共存していることを明らかにし、NTDの重要性を強調した。
また、ワクチンによって誘導された最初のNTD mAbsも報告しています。さらに、単離されたmAbの大部分は非中和性であることを示し、これは自然感染に比べてワクチン接種後の血清中に見られる高い結合率と中和率を反映している。
最後に、プラズマブラストのデータから、ワクチンによる反応の少なくとも一部は、ヒトβ-コロナウイルスに対する既存の免疫によって偏っていることが示唆された。
結果
mRNAワクチン接種によるポリクローナル抗体反応は、回復期の人で見られる抗体価を超えるが、非中和抗体の比率が高いことが特徴である
2020年末、進行中の観察研究の成人参加者6人が、mRNAベースのSARS-CoV-2ワクチンを接種した（表S1）。
これらの人々（V1-V6）の血液は、ワクチン接種前（4/6）、1回目のワクチン接種後、2回目のワクチン接種後など、いくつかの時点で採取された。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて、COVID-19生存者30人の免疫反応と比較して、組換えスパイクタンパクおよびRBDに対する免疫反応を調べた（図1Aおよび1B、表S1）。
生存者の血清は、抗スパイク力に基づいて選択し、抗体反応の強さに追従する可能性のあるさまざまな特徴を特定しやすくするために、3つのグループ（低＋：n＝8、中等＋＋：n＝11、高＋＋＋：n＝11、症状発症後111〜273日目に撮影されたマウントサイナイのCLIA研究所（Wajnberg et al.2020）で測定された抗体価に基づく）に分類した。
6人のワクチン接種者のうち5人が、ピーク時には高力価の回復期グループでさえ観察された反応よりも顕著に高い抗スパイクおよび抗RBD反応を示したが、1人のワクチン接種者（V4）は高力価グループと同等の力価を示した。
特筆すべきは、2回目のワクチン接種から1週間後に抗体反応がピークに達し、その後数週間にわたって抗体価が低下したことで、ワクチン接種に対する抗体反応として期待されている。
興味深いことに、抗RBD抗体価は、抗スパイク抗体価よりも早く低下するようであり、経時的にはより安定しているようであった。また、以下のような測定も行った。
興味深いことに、抗RBD抗体価は抗スパイク抗体価よりも早く低下し、経時的にもより安定しているように見えた。
また、本物のSARS-CoV-2を用いて中和抗体価を測定したところ、V4が遅れて反応したにもかかわらず、すべてのワクチン接種者が高い中和抗体価を示し、同様の傾向が見られた（図1C）。
重要なことは、反応のピーク時には、ワクチン群の中和力価は高回復期群の上限に達していたものの、著しく上回ることはなかったことである。
この結果を受けて、中和抗体に結合するスパイクの割合を計算してみた。
回復者群では、高反応の回復者よりも低力価の人の方が中和抗体に結合する割合が高いことがわかった（図1D）。
反応がピークに達した時点で判断すると、ワクチン接種者の中和抗体への結合割合が最も高かったことから、免疫反応が非中和抗体に集中しているか、あるいは一般的に力の弱い中和抗体が誘導されていることを示している（またはその両方）。
これらの比率は時間の経過しても安定しており、ワクチン接種者の中和抗体に対する結合の比率は、3つの回復期グループのいずれよりも有意に高かった（3つのグループでそれぞれp = 0.0004、0.0002、0.0041；図S1）。
また、スパイク結合とRBD結合の比率を調べたところ、ワクチン接種者では時間の経過とともにRBD結合が減少するという一般的な傾向が見られた以外は、回復者との違いは見られなかった（図S1）。
これらの人々（V1-V6）の血液は、ワクチン接種前（4/6）、1回目のワクチン接種後、2回目のワクチン接種後など、いくつかの時点で採取された。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて、COVID-19生存者30人の免疫反応と比較して、組換えスパイクタンパクおよびRBDに対する免疫反応を調べた（図1Aおよび1B、表S1）。
生存者の血清は、抗スパイク力に基づいて選択し、抗体反応の強さに追従する可能性のあるさまざまな特徴を特定しやすくするために、3つのグループ（低＋：n＝8、中等＋＋：n＝11、高＋＋＋：n＝11、症状発症後111〜273日目に撮影されたマウントサイナイのCLIA研究所（Wajnberg et al.2020）で測定された抗体価に基づく）に分類した。
6人のワクチン接種者のうち5人が、ピーク時には高力価の回復期グループでさえ観察された反応よりも顕著に高い抗スパイクおよび抗RBD反応を示したが、1人のワクチン接種者（V4）は高力価グループと同等の力価を示した。
特筆すべきは、2回目のワクチン接種から1週間後に抗体反応がピークに達し、その後数週間にわたって抗体価が低下したことで、ワクチン接種に対する抗体反応として期待されている。
興味深いことに、抗RBD抗体価は、抗スパイク抗体価よりも早く低下するようであり、経時的にはより安定しているようであった。また、以下のような測定も行った。
興味深いことに、抗RBD抗体価は抗スパイク抗体価よりも早く低下し、経時的にもより安定しているように見えた。
また、本物のSARS-CoV-2を用いて中和抗体価を測定したところ、V4が遅れて反応したにもかかわらず、すべてのワクチン接種者が高い中和抗体価を示し、同様の傾向が見られた（図1C）。
重要なことは、反応のピーク時には、ワクチン群の中和力価は高回復期群の上限に達していたものの、著しく上回ることはなかったことである。
この結果を受けて、中和抗体に結合するスパイクの割合を計算してみた。
回復者群では、高反応の回復者よりも低力価の人の方が中和抗体に結合する割合が高いことがわかった（図1D）。
反応がピークに達した時点で判断すると、ワクチン接種者の中和抗体への結合割合が最も高かったことから、免疫反応が非中和抗体に集中しているか、あるいは一般的に力の弱い中和抗体が誘導されていることを示している（またはその両方）。
これらの比率は時間の経過しても安定しており、ワクチン接種者の中和抗体に対する結合の比率は、3つの回復期グループのいずれよりも有意に高かった（3つのグループでそれぞれp = 0.0004、0.0002、0.0041；図S1）。
また、スパイク結合とRBD結合の比率を調べたところ、ワクチン接種者では時間の経過とともにRBD結合が減少するという一般的な傾向が見られた以外は、回復者との違いは見られなかった（図S1）。
mRNAワクチン接種により、季節性βコロナウイルスのスパイクタンパク質に対して、測定可能な免疫反応が誘導される
SARS-CoV-2感染は、ヒト集団の大部分が既存の免疫を持っているヒトコロナウイルス（hCoV）に対して、抗原原罪タイプの免疫反応を誘導することが報告されている（Aydilloら、2021年、Songら、2020年）。
ここでは、この現象がSARS-CoV-2 mRNAワクチン接種によっても誘発されるかどうかを検討した。
4人のワクチン接種者のα-コロナウイルス229EとNL63のスパイクタンパク質に対する抗体価は、ワクチン接種前の時点で検出されたが、ワクチン接種後には大きく上昇しなかった（図1Eと1F；V5とV6についてはワクチン接種前の血清が入手できなかった）。
しかし、β-コロナウイルスOC43およびHKU1のスパイクタンパクに対する力価は、これら4人のワクチン接種後に大きく上昇した（図1Gおよび1H）。
このように、mRNAのSARS-CoV-2スパイクをワクチン接種すると、SARS-CoV-2の自然感染で報告されているのと同様に、季節性β-コロナウイルスのスパイクタンパク質に対する免疫応答も高まる。
ここでは、この現象がSARS-CoV-2 mRNAワクチン接種によっても誘発されるかどうかを検討した。
4人のワクチン接種者のα-コロナウイルス229EとNL63のスパイクタンパク質に対する抗体価は、ワクチン接種前の時点で検出されたが、ワクチン接種後には大きく上昇しなかった（図1Eと1F；V5とV6についてはワクチン接種前の血清が入手できなかった）。
しかし、β-コロナウイルスOC43およびHKU1のスパイクタンパクに対する力価は、これら4人のワクチン接種後に大きく上昇した（図1Gおよび1H）。
このように、mRNAのSARS-CoV-2スパイクをワクチン接種すると、SARS-CoV-2の自然感染で報告されているのと同様に、季節性β-コロナウイルスのスパイクタンパク質に対する免疫応答も高まる。
SARS-CoV-2 mRNAのワクチン接種に対するプラズマブラストの反応は、RBDとNTDの両方を標的とする
ワクチン接種に対するB細胞の反応を偏りなく明らかにするために、ブースター免疫の6日後に3人（V3、V5、V6）から得られた血液検体からプラスマブラストを単一細胞で選別した（図S2）。
すべてのmAbは、単細胞培養されたプラスマブラストから生成され、組換えSARS-CoV-2スパイクタンパクとの結合を調べた。
V3から合計21個（40個のmAbがスクリーニングされ、28個がクローン的にユニークであった、表S2）、
V5から6個（82個がスクリーニングされ、20個がユニーク）、V6から15個（84個がスクリーニングされ、24個がユニーク）のスパイク反応性mAbが単離された（図2A）。
組み替えたスパイク、RBD、NTD、S2タンパク質を用いて、これらのmAbが結合するドメインをマッピングした。
興味深いことに、これらの抗体のうち、RBDを認識したのはごく少数であった（V3では24％、V6では47％、V5ではRBD結合体は確認されなかった）（図2Bおよび2E）。
また、V3では14％、V5では33％、V6では33％と、かなりの数の単離されたmAbがNTDに結合した（図2Cおよび2E）。
これらのデータは、RBDとNTDが、mRNAによって誘導されるプラスマブラスト応答の文脈において共優勢であることを示している。
残りのスパイク結合mAbの大部分（V3で52％、V5で50％、V6で20％）のエピトープは、S2にマッピングされた（図2Dおよび2E）。
わずか3つのmAbだけが、結合ターゲットを占めていなかった（V3に2つ、V5に1つ、図2E）。
すべてのmAbは、単細胞培養されたプラスマブラストから生成され、組換えSARS-CoV-2スパイクタンパクとの結合を調べた。
V3から合計21個（40個のmAbがスクリーニングされ、28個がクローン的にユニークであった、表S2）、
V5から6個（82個がスクリーニングされ、20個がユニーク）、V6から15個（84個がスクリーニングされ、24個がユニーク）のスパイク反応性mAbが単離された（図2A）。
組み替えたスパイク、RBD、NTD、S2タンパク質を用いて、これらのmAbが結合するドメインをマッピングした。
興味深いことに、これらの抗体のうち、RBDを認識したのはごく少数であった（V3では24％、V6では47％、V5ではRBD結合体は確認されなかった）（図2Bおよび2E）。
また、V3では14％、V5では33％、V6では33％と、かなりの数の単離されたmAbがNTDに結合した（図2Cおよび2E）。
これらのデータは、RBDとNTDが、mRNAによって誘導されるプラスマブラスト応答の文脈において共優勢であることを示している。
残りのスパイク結合mAbの大部分（V3で52％、V5で50％、V6で20％）のエピトープは、S2にマッピングされた（図2Dおよび2E）。
わずか3つのmAbだけが、結合ターゲットを占めていなかった（V3に2つ、V5に1つ、図2E）。
SARS-CoV2ワクチン接種者から分離されたmAbsの大部分は非中和性である
すべての抗体を対象に、SARS-CoV-2のUSA-WA1/2020株に対する中和活性を調べた。
RBDを標的とした結合抗体であっても、中和活性を示したのは少数派であった（図2Fおよび2G）。
V3については、21個のmAbのうち1個（RBD結合体）のみ（5％）が中和活性を示した（図2G）。V5については、1つのNTD抗体が本物のSARS-CoV-2を中和した（17％）（図2G）。
中和抗体の頻度が最も高かったのはV6（33％）で、1つのRBD中和抗体と4つのNTD中和抗体があった（図2G）。
興味深いことに、中和力が最も高かったのは、NTD中和剤であるmAb PVI.V5-6で、次いでRBD中和剤であるPVI.V6-4であった。
また、すべてのmAbについて、229E、NL63、HKU1、OC43の4つのhCoVのスパイクタンパク質との反応性を調べた。
α-コロナウイルス229EとNL63のスパイクタンパク質に対する抗体の結合は認められなかったが、SARS-CoV-2と同様にβ-コロナウイルスであるOC43のスパイクに、程度の差こそあれ結合する5つのmAb（V3から3つ、V5から1つ、V6から1つ）を同定した（図2H）。
3つのmAbは強い結合を示したが（PVI.V3-8、PVI.V3-12、PVI.V6-1）、PVI.V3-17は中間的な結合表現タイプを示し、PVI-V5-1は非常に弱く結合した。
また、これらのmAbのうち3つは、別のβコロナウイルスであるHKU1のスパイクとの結合を示した。
これらのうち、PVI.V6-1は非常に弱い結合しか示さなかったが、PVI.3-8とPVI.3-12は高い親和性を示す低い最小結合濃度（MBC）を示した（図2I）。
RBDを標的とした結合抗体であっても、中和活性を示したのは少数派であった（図2Fおよび2G）。
V3については、21個のmAbのうち1個（RBD結合体）のみ（5％）が中和活性を示した（図2G）。V5については、1つのNTD抗体が本物のSARS-CoV-2を中和した（17％）（図2G）。
中和抗体の頻度が最も高かったのはV6（33％）で、1つのRBD中和抗体と4つのNTD中和抗体があった（図2G）。
興味深いことに、中和力が最も高かったのは、NTD中和剤であるmAb PVI.V5-6で、次いでRBD中和剤であるPVI.V6-4であった。
また、すべてのmAbについて、229E、NL63、HKU1、OC43の4つのhCoVのスパイクタンパク質との反応性を調べた。
α-コロナウイルス229EとNL63のスパイクタンパク質に対する抗体の結合は認められなかったが、SARS-CoV-2と同様にβ-コロナウイルスであるOC43のスパイクに、程度の差こそあれ結合する5つのmAb（V3から3つ、V5から1つ、V6から1つ）を同定した（図2H）。
3つのmAbは強い結合を示したが（PVI.V3-8、PVI.V3-12、PVI.V6-1）、PVI.V3-17は中間的な結合表現タイプを示し、PVI-V5-1は非常に弱く結合した。
また、これらのmAbのうち3つは、別のβコロナウイルスであるHKU1のスパイクとの結合を示した。
これらのうち、PVI.V6-1は非常に弱い結合しか示さなかったが、PVI.3-8とPVI.3-12は高い親和性を示す低い最小結合濃度（MBC）を示した（図2I）。
スパイク反応性プラスマブラスト反応は、IgG1+細胞が主であり、体細胞超変異（SHM）のレベルが低い細胞と高い細胞の混合物で構成されている
3人のワクチン接種者（V3、V5、V6）のバルクソートされたプラスマブラストを対象に、シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）を実施し、ワクチンで誘導されたプラスマブラストの転写プロファイル、アイソタイプの分布、体細胞超変異（SHM）を包括的に調べた。
被験者V3、V5、V6からそれぞれ4,584個、3,523個、4,461個のシングルセルを解析した。
まず、B細胞受容体（BCR）の発現（図3A）と、PRDM1、XBP1、MZB1などのプラスマブラストの分化に不可欠な正則転写因子の発現（図3B）を合わせて調べることで、配列決定された細胞がプラスマブラストであることを確認した。
解析したプラスマブラストの中からワクチンに反応するB細胞クローンを同定するために、scRNA-seqを用いて、遺伝子発現と、選別したプラスマブラストからのV(D)Jライブラリも解析した。
分析したプラスマブラストの中からワクチンに反応するB細胞クローンを特定するために、scRNA-seqを用いて、遺伝子発現や選別したプラスマブラストのV(D)Jライブラリも分析し、スパイク特異的mAbが作られたBCR配列とクローン的に照合した。
この方法により、scRNA-seqデータから、被験者V3、V5、V6に由来するスパイク結合mAbとクローン的に関連するBCR配列を、それぞれ332、7、1,384個回収した（図3C）。
ここで重要なのは、3人のワクチン接種者それぞれからクローン化して発現させたすべてのmAbについて、クローン的に関連する配列を回収することができなかったということである。
次に、回収した配列のアイソタイプとIgGサブクラスの分布を調べた。
3人の被接種者では、IgG1が圧倒的に優勢なアイソタイプであった（図3D）。
最後に、3人の被験者から得られたmAb関連配列における体細胞超変異（SHM）のレベルを評価した。
比較のために、以前に発表されたヒトのナイーブB細胞および季節性インフルエンザウイルスのワクチン接種で誘発されたプラスマブラストで観察されたSHMレベルを用いた（Turnerら、2020年）。
V3とV6のスパイク反応性プラスマブラストは、V5ではなく、ナイーブなB細胞で観察されたものよりも有意に大きいレベルでSHMを蓄積していた（図3E、左）。
驚くべきことに、V6のプラスマブラストのSHMレベルは、季節性インフルエンザウイルスのワクチン接種後に観察されたものと同等であった（図3E、左）。
私たちは、スパイク反応を示すプラスマブラストのSHMレベルが高いのは、ヒトβ-コロナウイルスと共通の保存されたエピトープを標的としたものに由来するのではないかと考えた。
実際、交差反応性mAbに関連するクローンのSHMレベルは、非交差反応性のクローンに比べて有意に高いことがわかった（図3E、右）。
被験者V3、V5、V6からそれぞれ4,584個、3,523個、4,461個のシングルセルを解析した。
まず、B細胞受容体（BCR）の発現（図3A）と、PRDM1、XBP1、MZB1などのプラスマブラストの分化に不可欠な正則転写因子の発現（図3B）を合わせて調べることで、配列決定された細胞がプラスマブラストであることを確認した。
解析したプラスマブラストの中からワクチンに反応するB細胞クローンを同定するために、scRNA-seqを用いて、遺伝子発現と、選別したプラスマブラストからのV(D)Jライブラリも解析した。
分析したプラスマブラストの中からワクチンに反応するB細胞クローンを特定するために、scRNA-seqを用いて、遺伝子発現や選別したプラスマブラストのV(D)Jライブラリも分析し、スパイク特異的mAbが作られたBCR配列とクローン的に照合した。
この方法により、scRNA-seqデータから、被験者V3、V5、V6に由来するスパイク結合mAbとクローン的に関連するBCR配列を、それぞれ332、7、1,384個回収した（図3C）。
ここで重要なのは、3人のワクチン接種者それぞれからクローン化して発現させたすべてのmAbについて、クローン的に関連する配列を回収することができなかったということである。
次に、回収した配列のアイソタイプとIgGサブクラスの分布を調べた。
3人の被接種者では、IgG1が圧倒的に優勢なアイソタイプであった（図3D）。
最後に、3人の被験者から得られたmAb関連配列における体細胞超変異（SHM）のレベルを評価した。
比較のために、以前に発表されたヒトのナイーブB細胞および季節性インフルエンザウイルスのワクチン接種で誘発されたプラスマブラストで観察されたSHMレベルを用いた（Turnerら、2020年）。
V3とV6のスパイク反応性プラスマブラストは、V5ではなく、ナイーブなB細胞で観察されたものよりも有意に大きいレベルでSHMを蓄積していた（図3E、左）。
驚くべきことに、V6のプラスマブラストのSHMレベルは、季節性インフルエンザウイルスのワクチン接種後に観察されたものと同等であった（図3E、左）。
私たちは、スパイク反応を示すプラスマブラストのSHMレベルが高いのは、ヒトβ-コロナウイルスと共通の保存されたエピトープを標的としたものに由来するのではないかと考えた。
実際、交差反応性mAbに関連するクローンのSHMレベルは、非交差反応性のクローンに比べて有意に高いことがわかった（図3E、右）。
RBD結合中和mAbとACE2との競合、およびバリアントRBDのヒトACE2に対する親和性
2種類のmAbが中和してRBDに結合することが確認された。
そこで、これらのmAbがACE2と競合してRBDに結合するかどうかを調べてみた。
実際、濃度依存性の競合が両mAbで観察され、ACE2の結合を阻害することが両mAbの作用機序であることが示された（図4）。
抗体結合の分析のために、VOC変異株のRBDタンパク質を用意したので（下記参照）、各変異株のRBDのヒトACE2に対する親和性も評価したいと考えた。
バイオレイヤー干渉計（BLI）を用いて、N501Y RBD変異体（B.1.1.7はこの変異を唯一のRBD変異として搭載している）、ミンクの単離株に見られるY453F（Larsen et al, 2021年）、ヨーロッパの一部のクローンに見られるN439K（Thomsonら、2021年）、Y453FとN439Kの組み合わせ、E484K（B.1.351およびP.1の一部）、ならびにヒトACE2の組換えバージョンのB.1.351およびP.1のRBDについても同様である（図4A、4B、および4D）。
RBDの一重および二重変異のほとんどすべてが、ヒトACE2に対する親和性を高めていた。
具体的には、N501YとY453FにN439Kを組み合わせると、ヒトACE2に対する親和性が5倍になった（図4DおよびS3）。
一方、E484Kは単独では4倍も親和性が低下した。
なお、B.1.351 RBDのACE2に対する親和性は、野生型RBDのそれと同等であった。
これらのデータは、ELISAを用いた方法で確認したところ、同じ傾向を示した（図S4）。
そこで、これらのmAbがACE2と競合してRBDに結合するかどうかを調べてみた。
実際、濃度依存性の競合が両mAbで観察され、ACE2の結合を阻害することが両mAbの作用機序であることが示された（図4）。
抗体結合の分析のために、VOC変異株のRBDタンパク質を用意したので（下記参照）、各変異株のRBDのヒトACE2に対する親和性も評価したいと考えた。
バイオレイヤー干渉計（BLI）を用いて、N501Y RBD変異体（B.1.1.7はこの変異を唯一のRBD変異として搭載している）、ミンクの単離株に見られるY453F（Larsen et al, 2021年）、ヨーロッパの一部のクローンに見られるN439K（Thomsonら、2021年）、Y453FとN439Kの組み合わせ、E484K（B.1.351およびP.1の一部）、ならびにヒトACE2の組換えバージョンのB.1.351およびP.1のRBDについても同様である（図4A、4B、および4D）。
RBDの一重および二重変異のほとんどすべてが、ヒトACE2に対する親和性を高めていた。
具体的には、N501YとY453FにN439Kを組み合わせると、ヒトACE2に対する親和性が5倍になった（図4DおよびS3）。
一方、E484Kは単独では4倍も親和性が低下した。
なお、B.1.351 RBDのACE2に対する親和性は、野生型RBDのそれと同等であった。
これらのデータは、ELISAを用いた方法で確認したところ、同じ傾向を示した（図S4）。
VOC変異株に見られる変異を持つRBDに対するポリクローナル血清およびmAbの結合プロファイル
次に、ワクチン接種を受けた人、COVID-19生存者の血清、およびプラスマブラスト由来のmAbと変異型RBDとの結合を評価した。
RBDのパネルには、公表されているmAbのエスケープ変異体、ニューヨークのMount Sinai Health Systemで治療を受ける患者のMount Sinai Hospital's Pathogen Surveillance Programで検出されたRBD変異体のほか、VOI株やVOC株に見られる変異体（Baumら、2020年、Greaneyら、2021b、Larsenら、2021年、Thomsonら、2021年、Weisblumら、2020年）が含まれている。
回復期の人の血清は、ウイルスの変異体に応じて強い変動を示した（図5A）。
一般に、単一の変異体であるE406Q、E484K、F490Kが結合に最も大きな影響を及ぼした。
しかし、完全に結合力が失われることは稀で、2〜4倍の結合力の低下が一般的であった。興味深いことに、ほとんどすべての血清が、野生型RBDよりもN501Y RBD（B.1.1.7）によく結合した（野生型に比べて平均129％）。
逆に、B.1.351のRBDでは、平均して39％の結合率の低下が見られました。P.1 RBDでは、その影響はわずかに低かった（野生型と比較して平均70％の結合率）。
しかし、ワクチンを接種した6人の血清では、E406Q、N440K、E484K、F490Kで最も高い減少率を示したのはわずか2倍であった（図5B）。
注目すべきは、ワクチン接種者の後期のサンプル（V1=d89、V2=d102、V3=d47、V4=d48、V5=49、V6=48）をアッセイし、ある程度の親和性の成熟を図ったことである。
また、E484K、F484A、B.1.351、P.1で観察された最も高い減少率は約2倍であったが、これは6人のワクチン全員に当てはまるものではなかった。
いくつかのワクチンは、これらのRBDに対する結合レベルを野生型RBDと同等のレベルに維持していた。
RBDに結合するmAbは、同じ変異体への結合についてもテストされた。
一般に、mAbsは、いくつかの例外を除き、野生型RBDで見られた結合の2倍以内の結合レベルを維持した。
実際、ほとんどのmAbでは、結合への影響は見られなかった（図5C）。
ただし、PVI.V3-9は例外で、F486Aを持つRBDとの結合が失われた。B.1.351変異体に対するいくつかのmAbの結合にはマイナスの影響が見られたが、P.1変異体のRBDの変異による結合への影響はほとんど見られなかった。
PVI.V6-4という1つのmAbだけが、P.1に対する結合性の低下を示した。
RBDのパネルには、公表されているmAbのエスケープ変異体、ニューヨークのMount Sinai Health Systemで治療を受ける患者のMount Sinai Hospital's Pathogen Surveillance Programで検出されたRBD変異体のほか、VOI株やVOC株に見られる変異体（Baumら、2020年、Greaneyら、2021b、Larsenら、2021年、Thomsonら、2021年、Weisblumら、2020年）が含まれている。
回復期の人の血清は、ウイルスの変異体に応じて強い変動を示した（図5A）。
一般に、単一の変異体であるE406Q、E484K、F490Kが結合に最も大きな影響を及ぼした。
しかし、完全に結合力が失われることは稀で、2〜4倍の結合力の低下が一般的であった。興味深いことに、ほとんどすべての血清が、野生型RBDよりもN501Y RBD（B.1.1.7）によく結合した（野生型に比べて平均129％）。
逆に、B.1.351のRBDでは、平均して39％の結合率の低下が見られました。P.1 RBDでは、その影響はわずかに低かった（野生型と比較して平均70％の結合率）。
しかし、ワクチンを接種した6人の血清では、E406Q、N440K、E484K、F490Kで最も高い減少率を示したのはわずか2倍であった（図5B）。
注目すべきは、ワクチン接種者の後期のサンプル（V1=d89、V2=d102、V3=d47、V4=d48、V5=49、V6=48）をアッセイし、ある程度の親和性の成熟を図ったことである。
また、E484K、F484A、B.1.351、P.1で観察された最も高い減少率は約2倍であったが、これは6人のワクチン全員に当てはまるものではなかった。
いくつかのワクチンは、これらのRBDに対する結合レベルを野生型RBDと同等のレベルに維持していた。
RBDに結合するmAbは、同じ変異体への結合についてもテストされた。
一般に、mAbsは、いくつかの例外を除き、野生型RBDで見られた結合の2倍以内の結合レベルを維持した。
実際、ほとんどのmAbでは、結合への影響は見られなかった（図5C）。
ただし、PVI.V3-9は例外で、F486Aを持つRBDとの結合が失われた。B.1.351変異体に対するいくつかのmAbの結合にはマイナスの影響が見られたが、P.1変異体のRBDの変異による結合への影響はほとんど見られなかった。
PVI.V6-4という1つのmAbだけが、P.1に対する結合性の低下を示した。
ワクチン接種後のポリクローナル血清からのNTDおよびE484K変異ウイルスの脱出はごくわずかだが、NTD変異はNTD結合mAbの中和活性に大きな影響を与える
このウイルスは、NTDに2つの変異（W64R、L141Y）と1つの欠失（Δ142-145）、さらにRBDにE484K変異を持つSARS-CoV-2分離株PV14252（Clade 20C, Pango lineage B.1）をマウントサイナイ病院の病原体サーベイランスプログラムを通じて入手した（図5D）。
ワクチン接種後の血清による中和に対するこのウイルス変異体の感受性を調べるため、マイクロ中和アッセイを行った。
野生型 SARS-CoV-2 と PV14252 を並行して試験し、両ウイルスのアッセイセットアップを比較できるようにした。
ワクチン接種者のポリクローナル血清の中和活性を調べたところ、比較的軽微な影響が見られた（図5E）。V2、V5、V6の血清の活性はわずかに上昇し、V1、V3、V4の活性は低下した。
次に、プラスマブラストから分離した7種類の中和性mAbを試験した。変形RBD ELISAにおける結合プロファイルと同様に、2つのRBD mAbsは、同等の効率で両ウイルスを中和した（図5F）。
実際、PVI.V3-9の活性はわずかに上昇した（図5F）。
これとは対照的に、5つの抗NTD抗体はすべて、このウイルス分離株のNTDに存在する変異のため、PV14252に対する中和活性を完全に失った。
ワクチン接種後の血清による中和に対するこのウイルス変異体の感受性を調べるため、マイクロ中和アッセイを行った。
野生型 SARS-CoV-2 と PV14252 を並行して試験し、両ウイルスのアッセイセットアップを比較できるようにした。
ワクチン接種者のポリクローナル血清の中和活性を調べたところ、比較的軽微な影響が見られた（図5E）。V2、V5、V6の血清の活性はわずかに上昇し、V1、V3、V4の活性は低下した。
次に、プラスマブラストから分離した7種類の中和性mAbを試験した。変形RBD ELISAにおける結合プロファイルと同様に、2つのRBD mAbsは、同等の効率で両ウイルスを中和した（図5F）。
実際、PVI.V3-9の活性はわずかに上昇した（図5F）。
これとは対照的に、5つの抗NTD抗体はすべて、このウイルス分離株のNTDに存在する変異のため、PV14252に対する中和活性を完全に失った。
B.1.1.7とB.1.351はプラスマブラスト由来の中和抗体から部分的に逃れている
さらに、VOC株 B.1.1.7とB.1.351に対して、2つのRBD抗体と5つのNTD抗体の中和活性を調べた（図5G）。
どちらの変異体もNTDに変異だけでなく欠失も含まれている。
さらに、B.1.1.7はRBDにN501Yの変異を持ち、B.1.351はRBDにN417K、E484K、N501Yの変異を持つ（図4Aおよび4B）。
この2つのRBD結合抗体は、B.1.1.7に対する中和活性を全く（PVI.V6-4）またはほとんど（PVI.V3-9）失った。
しかし、PVI.V3-9はB.1.351に対する活性をすべて失い、PVI.V6-4の残りの中和活性は低かった（しかし、測定可能であった）。
1つ（PVI.V6-11）を除くすべてのNTD mAbsがB.1.1.7に対する中和活性を失い、すべてのNTD mAbsがB.1.351に対する中和活性を失ったことから、抗体活性におけるNTDの変化の重要性が改めて浮き彫りになった。
どちらの変異体もNTDに変異だけでなく欠失も含まれている。
さらに、B.1.1.7はRBDにN501Yの変異を持ち、B.1.351はRBDにN417K、E484K、N501Yの変異を持つ（図4Aおよび4B）。
この2つのRBD結合抗体は、B.1.1.7に対する中和活性を全く（PVI.V6-4）またはほとんど（PVI.V3-9）失った。
しかし、PVI.V3-9はB.1.351に対する活性をすべて失い、PVI.V6-4の残りの中和活性は低かった（しかし、測定可能であった）。
1つ（PVI.V6-11）を除くすべてのNTD mAbsがB.1.1.7に対する中和活性を失い、すべてのNTD mAbsがB.1.351に対する中和活性を失ったことから、抗体活性におけるNTDの変化の重要性が改めて浮き彫りになった。
考察
SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種に対するB細胞の反応については、まだ完全には解明されていない。
ポリクローナルワクチンによる応答の性質や、プラスマブラストによる応答の偏りのない詳細な分析についての情報が早急に必要である。
今回のデータは、自然感染に対する免疫反応と比較して、これらの反応に関する重要な新しい洞察を与えてくれる。
実際、SARS-CoV-2の感染では、スパイクタンパク質に対する抗体の量が非常に不均一であることがわかった。
対照的に、mRNAワクチン接種では、比較的均一な力価の高い抗体反応が誘導されるようだ。
しかし、COVID-19生存者よりもワクチン接種者の方が非中和抗体を多く産生するため、中和抗体と結合抗体の比率が低くなることもわかった。
これらのデータは、初期の臨床試験ですでに明らかになっていたが、当時はまだ認識されていなかった（Walshら、2020年）。
興味深いことに、低力価の回復期血清は中和抗体の相対量が最も多く、一方、結合抗体の割合は測定された抗体価が高い血清で増加していた。
ワクチン接種後に採取された形質細胞の大部分は、実際には非中和抗体を産生しているのである。
最近の2つの研究では、SARS-CoV-2に自然感染した人を対象に、同様に偏りのないプラスマブラスト分析を行っている（Choら、2021年；Huangら、2021年）。
もちろん、SARS-CoV-2感染後の抗体反応は、スパイクタンパク質だけでなく、ウイルスが発現する他のいくつかのタンパク質も標的としている。
スパイクの結合のみを考慮した場合、これらの研究では中和抗体の割合は44％と25％と報告されている（Choら、2021年、Huangら、2021年）。
プラスマブラスト分析は一般的に定量的ではないが（例：クローンタイプごとに1つのクローンを選択するなど）、私たちがワクチン接種後のプラスマブラストを分析したところ、中和抗体の数は17％と少なかった。
SARS-CoV-2の免疫防御における中和抗体以外の抗体の役割を明らかにするには、今後の研究が必要である。
実際、中和以外の抗体機能が防御と相関することが示されている（Bartchら、2021年、Gormanら、2021年、Schäferら、2021年）。
比率ではなく絶対的な抗体価の重要性は、ワクチン接種後の中和力価が高応答者の回復者グループで見られた力価と同等かそれ以上であったという事実によって強調されている。
ヒトに広く分布している4種類の季節性CoVのうち，β-コロナウイルスOC43とHKU1は，SARS-CoV-2スパイクとの相同性が高い。
ワクチンを接種した人は、OC43とHKU1のスパイクタンパク質には反応したが、α-コロナウイルス229EとNL63には反応しなかった。
この現象は、インフルエンザウイルスの免疫学で説明されている免疫インプリンティングに似ており、SARS-CoV-2の自然感染でもβ-コロナウイルスに対する「バックブースト」が認められている(Aydillo et al., 2021; Song et al., 2020)。
我々の研究で単離されたmAbのいくつかは、実際にそのような交差反応の表現型を持っていた。
ほとんどがS2エピトープを標的とするこれらの抗体が、SARS-CoV-2、OC43、またはHKU1の感染防御に貢献しているかどうかはまだ不明である。
しかし、SARS-CoV-2、HKU1、OC43のスパイクと結合するmAbの交差反応性エピトープは、将来の汎βコロナウイルスワクチンの基礎となる可能性がある。
これらのmAbを産生するB細胞は、リコール反応に由来し、ヒトβ-コロナウイルスによって最初に誘導されたと考えられるが（これは血清学的にも、もちろんmAbが示す広範なSHMによっても裏付けられている）、仮に新規に誘導された抗体である可能性もある。
おそらくそうではないだろうが、今回のデータではこの可能性を排除することはできない。
もう一つの興味深い点は、RBDとNTDが共存していることである。
SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種に対するB細胞応答に関する以前の分析では、標識されたRBDでベイトされた細胞に焦点を当てていた（Wangら、2021年）。
対照的に、我々は、抗原に依存しない方法でプラスマブラストを選別し、クローン化するという偏りのないアプローチをとった。
その結果、多くのmAbがRBDとNTD以外のエピトープに結合することで、NTDとRBDの結合量が同程度であることがわかった。
あるワクチン接種者では、RBDに結合するmAbsが1つも分離されなかったが、その人に由来するmAbsの全体数は少なく、ポリクローナル血清抗体反応にはRBD認識が含まれていたという注意点がある。
これらのデータは、中和エピトープを持つNTDが、少なくともRBDと同様に重要であり、同様に注目されるべきであることを示唆している。
実際、今回分離された7つの中和抗体のうち、5つがNTDに結合し、RBDを標的としたものは2つしかなかった。
自然感染後の形質細胞応答を分析した最近の研究では、RBDとNTDが同様に共優勢であることが判明しており（Choら、2021年、Huangら、2021年）、1つの研究では、RBDを標的とする59個のmAb、NTDを標的とする64個のmAb、およびRBDおよびNTD以外に結合する46個のmAbが報告され、2つ目の研究では、10個のRBD mAbs、13個の非RBD S1結合mAb（NTD結合を強く示唆する）、および9個のS2を標的とするmAbが報告されている。
興味深いことに、我々の発見とは対照的に、mRNA-1273ワクチン接種者の血清を用いた最近の深い変異スキャンの論文では、非常に強いRBDに焦点を当てた反応が見られた（Greaneyら、2021a）。
我々の研究で得られたmAbsのさらなる特徴は、NTDに広範な変化を有する真正の複製可能な変種ウイルスに対する中和が完全に失われたことを示した。
また、すべてのNTD mAbsがB.1.351に対する中和活性を失い、1つを除くすべてのmAbsがB.1.1.7に対する活性を失った。
これらの観察結果は、B.1.1.7のRBDにおけるN501Yの置換が結合および中和活性に大きな影響を与えないにもかかわらず、いくつかの研究でVOC株に対する中和の低下が見られる理由を説明するものと思われる（Emaryら、2021年）。
抗体の標的としてのNTDの重要な役割は、最近、メモリーB細胞由来のmAbを用いても示されている(McCallum et al., 2021)。
さらに、異なるRBDの変異がヒトACE2に対する親和性に与える影響を評価した。
興味深いことに、N501Yでは親和性が5倍に増加した。この受容体結合親和性の増加は、この変異をRBDに持つB.1.1.7の高い感染力に寄与していると考えられる。
一方、E484Kを導入すると、親和性が4倍に低下した。
このことは、E484Kの変異のみを持つ変異株が効率的に拡散することがほとんどない理由を説明していると思われるが、2020年秋以降、マウントサイナイヘルスシステムで治療を受けている一握りの患者からE484Kを持つウイルスが検出されており、また、免疫不全の患者からも報告されている（Choi et al. 2020)
N501Y変異は、フィットネスを損なうことなくE484Kの獲得を可能にすると推測したくなるほどである。
実際、N501YとE484K（N417Kも同様）を持つB.1.351 RBDは、野生型RBDと同様のhACE2への結合を示した。
最近、英国ではN501Yに加えてE484Kを持つB.1.1.7の変異株が分離されており（Public Health England, 2021）、N501YによってRBDに受容体結合に有害な変異が獲得できるという仮説の証拠となっている。
しかし、ニューヨーク市でE484Kを持つがN501Yを持たないB.1.526が最近増殖していることから、この体力低下は、まだ特徴のない他のウイルスの変化によって克服される可能性があると考えられる（Annavajhalaら、2021年、Lasek-Nesselquistら、2021年）。
興味深いことに、N501Y RBDに対する回復期の血清の結合も増加したことから、受容体に対する親和性を高める変化は、受容体を模倣する可能性のある一連の抗体の親和性も高める可能性があることが示唆された。
また、RBDに対する2つの中和抗体は、E484K変異を持つ変異型RBDへの結合力がやや低下する一方で、E484K変異を唯一のRBDの変化として持つ変異型ウイルスに対する中和力は同程度か、あるいは増加することがわかった。
E484K変異型RBDのhACE2に対する親和性が低下すると、RBDに結合するmAbの影響を受けやすくなると考えられる。
したがって、RBDに結合する抗体は、高親和性のRBD-hACE2相互作用に比べて、低親和性のものを妨害するのに有効であると考えられる。
ウイルスの逃避メカニズムとしての親和性の向上は、過去にも説明されており（Hensleyら、2009年、O'Donnellら、2012年）、今回はその逆のメカニズムが働いている可能性がある。
現在のワクチンが、懸念されている流行株や新たに出現した変異株に対して効果的な保護を提供できるかどうかは、2021年初頭に多くの注目を集めた重要な問題である。
我々のデータによると、E484KおよびB.1.351バリアントのRBDへの結合の減少は、報告されている中和の減少（6〜8倍から完全な中和の喪失まで）に比べて軽微（多くの場合、わずか2倍）であった（Celeら、2021年、Wibmerら、2021年、Wuら、2021年）。
ここでは検証していないが、スパイクにはNTDとRBD以外にも多くのエピトープがあることから、全長スパイクへの結合の減少はさらに低いと考えられる。
本研究で観察された結合力の大きな維持は、ウイルスの変異体が、医学的、科学的、および公衆衛生上の理由から現在広く使用されている血清学的アッセイに与える影響が小さいことを示唆している。
また、結合性のある非中和抗体は、多くのウイルス感染症において保護効果があることが示されており（Asthagiri Arunkumarら、2019年、DiLilloら、2014年、Saphireら、2018年）、南アフリカで行われたB.1.351に対するJohnson & JohnsonとNovavaxのワクチン試験で見られた実質的な残存保護の要因となっている可能性がある（Shindeら、2021年）。
非中和抗体の産生は、中和抗体価が非常に低いか、存在しない時期に実質的に発生するため、初回投与後のmRNAワクチンによる保護にも役割を果たしている可能性がある（Badenら、2020年、Daganら、2021年、Polackら、2020年）。
最後に、一部の抗体は親和性の低下により中和活性を失うことがありますが、それでも結合する。
さらに、これらの特異性を持つB細胞は、変種ウイルスや変種スパイクを含むワクチンにさらされた後、親和性の成熟が進む可能性があり、VOCウイルスに対する高親和性の抗体ができる可能性がある。
以上のことから、SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種による抗体反応は、非中和抗体の割合が多く、NTD抗体とRBD抗体が共存することが明らかになった。
そのため、スパイクのNTD部分は重要なワクチンターゲットとなる。
すべてのVOC変異株は、この領域で大きく変異しているため、これらの観察結果は、SARS-CoV-2ワクチンを最適化するためにさらなる注意を要する。
最後に、β-コロナウイルスのスパイクタンパク質に対する広範な交差反応性のmAbがワクチン接種後に誘導されることから、汎β-コロナウイルスワクチンの開発の可能性が示唆された。
ポリクローナルワクチンによる応答の性質や、プラスマブラストによる応答の偏りのない詳細な分析についての情報が早急に必要である。
今回のデータは、自然感染に対する免疫反応と比較して、これらの反応に関する重要な新しい洞察を与えてくれる。
実際、SARS-CoV-2の感染では、スパイクタンパク質に対する抗体の量が非常に不均一であることがわかった。
対照的に、mRNAワクチン接種では、比較的均一な力価の高い抗体反応が誘導されるようだ。
しかし、COVID-19生存者よりもワクチン接種者の方が非中和抗体を多く産生するため、中和抗体と結合抗体の比率が低くなることもわかった。
これらのデータは、初期の臨床試験ですでに明らかになっていたが、当時はまだ認識されていなかった（Walshら、2020年）。
興味深いことに、低力価の回復期血清は中和抗体の相対量が最も多く、一方、結合抗体の割合は測定された抗体価が高い血清で増加していた。
ワクチン接種後に採取された形質細胞の大部分は、実際には非中和抗体を産生しているのである。
最近の2つの研究では、SARS-CoV-2に自然感染した人を対象に、同様に偏りのないプラスマブラスト分析を行っている（Choら、2021年；Huangら、2021年）。
もちろん、SARS-CoV-2感染後の抗体反応は、スパイクタンパク質だけでなく、ウイルスが発現する他のいくつかのタンパク質も標的としている。
スパイクの結合のみを考慮した場合、これらの研究では中和抗体の割合は44％と25％と報告されている（Choら、2021年、Huangら、2021年）。
プラスマブラスト分析は一般的に定量的ではないが（例：クローンタイプごとに1つのクローンを選択するなど）、私たちがワクチン接種後のプラスマブラストを分析したところ、中和抗体の数は17％と少なかった。
SARS-CoV-2の免疫防御における中和抗体以外の抗体の役割を明らかにするには、今後の研究が必要である。
実際、中和以外の抗体機能が防御と相関することが示されている（Bartchら、2021年、Gormanら、2021年、Schäferら、2021年）。
比率ではなく絶対的な抗体価の重要性は、ワクチン接種後の中和力価が高応答者の回復者グループで見られた力価と同等かそれ以上であったという事実によって強調されている。
ヒトに広く分布している4種類の季節性CoVのうち，β-コロナウイルスOC43とHKU1は，SARS-CoV-2スパイクとの相同性が高い。
ワクチンを接種した人は、OC43とHKU1のスパイクタンパク質には反応したが、α-コロナウイルス229EとNL63には反応しなかった。
この現象は、インフルエンザウイルスの免疫学で説明されている免疫インプリンティングに似ており、SARS-CoV-2の自然感染でもβ-コロナウイルスに対する「バックブースト」が認められている(Aydillo et al., 2021; Song et al., 2020)。
我々の研究で単離されたmAbのいくつかは、実際にそのような交差反応の表現型を持っていた。
ほとんどがS2エピトープを標的とするこれらの抗体が、SARS-CoV-2、OC43、またはHKU1の感染防御に貢献しているかどうかはまだ不明である。
しかし、SARS-CoV-2、HKU1、OC43のスパイクと結合するmAbの交差反応性エピトープは、将来の汎βコロナウイルスワクチンの基礎となる可能性がある。
これらのmAbを産生するB細胞は、リコール反応に由来し、ヒトβ-コロナウイルスによって最初に誘導されたと考えられるが（これは血清学的にも、もちろんmAbが示す広範なSHMによっても裏付けられている）、仮に新規に誘導された抗体である可能性もある。
おそらくそうではないだろうが、今回のデータではこの可能性を排除することはできない。
もう一つの興味深い点は、RBDとNTDが共存していることである。
SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種に対するB細胞応答に関する以前の分析では、標識されたRBDでベイトされた細胞に焦点を当てていた（Wangら、2021年）。
対照的に、我々は、抗原に依存しない方法でプラスマブラストを選別し、クローン化するという偏りのないアプローチをとった。
その結果、多くのmAbがRBDとNTD以外のエピトープに結合することで、NTDとRBDの結合量が同程度であることがわかった。
あるワクチン接種者では、RBDに結合するmAbsが1つも分離されなかったが、その人に由来するmAbsの全体数は少なく、ポリクローナル血清抗体反応にはRBD認識が含まれていたという注意点がある。
これらのデータは、中和エピトープを持つNTDが、少なくともRBDと同様に重要であり、同様に注目されるべきであることを示唆している。
実際、今回分離された7つの中和抗体のうち、5つがNTDに結合し、RBDを標的としたものは2つしかなかった。
自然感染後の形質細胞応答を分析した最近の研究では、RBDとNTDが同様に共優勢であることが判明しており（Choら、2021年、Huangら、2021年）、1つの研究では、RBDを標的とする59個のmAb、NTDを標的とする64個のmAb、およびRBDおよびNTD以外に結合する46個のmAbが報告され、2つ目の研究では、10個のRBD mAbs、13個の非RBD S1結合mAb（NTD結合を強く示唆する）、および9個のS2を標的とするmAbが報告されている。
興味深いことに、我々の発見とは対照的に、mRNA-1273ワクチン接種者の血清を用いた最近の深い変異スキャンの論文では、非常に強いRBDに焦点を当てた反応が見られた（Greaneyら、2021a）。
我々の研究で得られたmAbsのさらなる特徴は、NTDに広範な変化を有する真正の複製可能な変種ウイルスに対する中和が完全に失われたことを示した。
また、すべてのNTD mAbsがB.1.351に対する中和活性を失い、1つを除くすべてのmAbsがB.1.1.7に対する活性を失った。
これらの観察結果は、B.1.1.7のRBDにおけるN501Yの置換が結合および中和活性に大きな影響を与えないにもかかわらず、いくつかの研究でVOC株に対する中和の低下が見られる理由を説明するものと思われる（Emaryら、2021年）。
抗体の標的としてのNTDの重要な役割は、最近、メモリーB細胞由来のmAbを用いても示されている(McCallum et al., 2021)。
さらに、異なるRBDの変異がヒトACE2に対する親和性に与える影響を評価した。
興味深いことに、N501Yでは親和性が5倍に増加した。この受容体結合親和性の増加は、この変異をRBDに持つB.1.1.7の高い感染力に寄与していると考えられる。
一方、E484Kを導入すると、親和性が4倍に低下した。
このことは、E484Kの変異のみを持つ変異株が効率的に拡散することがほとんどない理由を説明していると思われるが、2020年秋以降、マウントサイナイヘルスシステムで治療を受けている一握りの患者からE484Kを持つウイルスが検出されており、また、免疫不全の患者からも報告されている（Choi et al. 2020)
N501Y変異は、フィットネスを損なうことなくE484Kの獲得を可能にすると推測したくなるほどである。
実際、N501YとE484K（N417Kも同様）を持つB.1.351 RBDは、野生型RBDと同様のhACE2への結合を示した。
最近、英国ではN501Yに加えてE484Kを持つB.1.1.7の変異株が分離されており（Public Health England, 2021）、N501YによってRBDに受容体結合に有害な変異が獲得できるという仮説の証拠となっている。
しかし、ニューヨーク市でE484Kを持つがN501Yを持たないB.1.526が最近増殖していることから、この体力低下は、まだ特徴のない他のウイルスの変化によって克服される可能性があると考えられる（Annavajhalaら、2021年、Lasek-Nesselquistら、2021年）。
興味深いことに、N501Y RBDに対する回復期の血清の結合も増加したことから、受容体に対する親和性を高める変化は、受容体を模倣する可能性のある一連の抗体の親和性も高める可能性があることが示唆された。
また、RBDに対する2つの中和抗体は、E484K変異を持つ変異型RBDへの結合力がやや低下する一方で、E484K変異を唯一のRBDの変化として持つ変異型ウイルスに対する中和力は同程度か、あるいは増加することがわかった。
E484K変異型RBDのhACE2に対する親和性が低下すると、RBDに結合するmAbの影響を受けやすくなると考えられる。
したがって、RBDに結合する抗体は、高親和性のRBD-hACE2相互作用に比べて、低親和性のものを妨害するのに有効であると考えられる。
ウイルスの逃避メカニズムとしての親和性の向上は、過去にも説明されており（Hensleyら、2009年、O'Donnellら、2012年）、今回はその逆のメカニズムが働いている可能性がある。
現在のワクチンが、懸念されている流行株や新たに出現した変異株に対して効果的な保護を提供できるかどうかは、2021年初頭に多くの注目を集めた重要な問題である。
我々のデータによると、E484KおよびB.1.351バリアントのRBDへの結合の減少は、報告されている中和の減少（6〜8倍から完全な中和の喪失まで）に比べて軽微（多くの場合、わずか2倍）であった（Celeら、2021年、Wibmerら、2021年、Wuら、2021年）。
ここでは検証していないが、スパイクにはNTDとRBD以外にも多くのエピトープがあることから、全長スパイクへの結合の減少はさらに低いと考えられる。
本研究で観察された結合力の大きな維持は、ウイルスの変異体が、医学的、科学的、および公衆衛生上の理由から現在広く使用されている血清学的アッセイに与える影響が小さいことを示唆している。
また、結合性のある非中和抗体は、多くのウイルス感染症において保護効果があることが示されており（Asthagiri Arunkumarら、2019年、DiLilloら、2014年、Saphireら、2018年）、南アフリカで行われたB.1.351に対するJohnson & JohnsonとNovavaxのワクチン試験で見られた実質的な残存保護の要因となっている可能性がある（Shindeら、2021年）。
非中和抗体の産生は、中和抗体価が非常に低いか、存在しない時期に実質的に発生するため、初回投与後のmRNAワクチンによる保護にも役割を果たしている可能性がある（Badenら、2020年、Daganら、2021年、Polackら、2020年）。
最後に、一部の抗体は親和性の低下により中和活性を失うことがありますが、それでも結合する。
さらに、これらの特異性を持つB細胞は、変種ウイルスや変種スパイクを含むワクチンにさらされた後、親和性の成熟が進む可能性があり、VOCウイルスに対する高親和性の抗体ができる可能性がある。
以上のことから、SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種による抗体反応は、非中和抗体の割合が多く、NTD抗体とRBD抗体が共存することが明らかになった。
そのため、スパイクのNTD部分は重要なワクチンターゲットとなる。
すべてのVOC変異株は、この領域で大きく変異しているため、これらの観察結果は、SARS-CoV-2ワクチンを最適化するためにさらなる注意を要する。
最後に、β-コロナウイルスのスパイクタンパク質に対する広範な交差反応性のmAbがワクチン接種後に誘導されることから、汎β-コロナウイルスワクチンの開発の可能性が示唆された。
本研究の限界
本研究は、SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種後の抗体反応を詳細に明らかにしたものであるが、いくつかの限界がある。
1つ目の限界は、研究参加者の数が少ないことで、この研究は定量的な研究ではなく定性的な研究となっている。
もう1つの限界は、SARS-CoV-2感染者のプラスマブラスト分析が行われていないことである。
我々は、SARS-CoV-2感染後のプラズマブラスト分析の発表データと我々のデータを比較したが、並べて比較した方がより正確だっただろう。
また、本研究では回復期の血清の縦断的な分析を行っていないが、幅広い時点と力価レベルを提供することで、この制限をある程度相殺できると考えている。
さらに、交差反応性プラズマブラストのクローンは、メモリー区画に由来し、季節性コロナウイルス感染によって最初に誘発された可能性が高いと考えらるが、ワクチン接種前のメモリーB細胞とB細胞受容体配列を分析していないため、最終的な証明はできていない。
最後に、豊富な非中和抗体が生体内で保護効果を持つかどうかという切実な問題は、追跡調査によって解明される必要がある。
1つ目の限界は、研究参加者の数が少ないことで、この研究は定量的な研究ではなく定性的な研究となっている。
もう1つの限界は、SARS-CoV-2感染者のプラスマブラスト分析が行われていないことである。
我々は、SARS-CoV-2感染後のプラズマブラスト分析の発表データと我々のデータを比較したが、並べて比較した方がより正確だっただろう。
また、本研究では回復期の血清の縦断的な分析を行っていないが、幅広い時点と力価レベルを提供することで、この制限をある程度相殺できると考えている。
さらに、交差反応性プラズマブラストのクローンは、メモリー区画に由来し、季節性コロナウイルス感染によって最初に誘発された可能性が高いと考えらるが、ワクチン接種前のメモリーB細胞とB細胞受容体配列を分析していないため、最終的な証明はできていない。
最後に、豊富な非中和抗体が生体内で保護効果を持つかどうかという切実な問題は、追跡調査によって解明される必要がある。
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