DIGノーザン
ノーザンブロット解析プロトコル(DIG)mikioだよ
10×MOPS 35ml
DW up to 350ml
ゲルの作製 ゲル(小) ゲル(大)
form aldehyde(37%) 1.1ml 1.65ml
1×MOPS 18.9ml 28.35ml
Agar 0.2g 0.3g
(Agarをレンジで溶かした後にform aldehydeを入れる)
sample RNAの調製
適量のtotalRNAを全量が10μl(15μl)になるようにDWでメスアップする
loading bufferの調製
formamide(100%) 250μl
formaldehyde(37%) 83μl
10×MOPS 50μl
50% glycerol 104.5μl
BPB(2%) 10μl
EtBr(10mg/ml) 2.5μl
(-20℃で保存可能)
Loading sampleの調製
Sample RNA 10μl(15μl)
Loading buffer 10μl(15μl)をmix
↓
65℃,10min
↓
氷冷
泳動
50V、60min泳動し、その後ゲルを写真撮影する
↓
ブロッティング台を組み立てる
↓
over night Membrane:Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech社)
c40d1bbb3dc0fc6d.pdf
ブロッティング後、membraneを2×SSCで浸した濾紙に、ブロット面が上になるように乗せる (ゲルを写真撮影して、ブロッティングがうまくいったか確認する)
↓
UV cross linkする
↓
DWで軽くすすぐ
↓
dry up
↓ (DIG Easy Hyb: Roche)
ハイブリバッファー4mlを入れたハイブリ管(50℃で暖めておく)にmembraneを入れる
↓
50℃、30min以上プレハイブリダイゼーションを行う
プローブ調製
適量のDIG probeをDWで全量50μlにメスアップする
↓
95℃,5min
↓
氷冷
ハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーション後、membraneに直接かからないようにプローブ全量をハイブリバッファーに加える
↓
50℃、over night、ストリンジェンシーバッファー(低:2×SSC,0.1%SDS、高:0.2×SSC,0.1%SDS)を50℃に暖めておく
↓
50℃、15min洗う(二回)
↓
高ストリンジェンシーバッファーで、50℃、15min洗う(二回)
↓
Wash buffer*で室温、2min洗う
↓
blocking buffer*(約30ml)で室温、30min以上ブロッキングする
↓
抗体溶液(Anti-DIG-AP* 2μl / blocking buffer *20ml)で室温、30min、抗体反応
↓
Wash buffer*で室温、15min洗う(二回)
↓
Detection buffer*(19ml)で室温、3min洗う
↓
平らにしたパラフィルムの上にCSPD*(1ml)を乗せ、その上にmembraneをブロット面が下に気泡が入らないように置き、その上にパラフィルムでサンドする
↓
室温、5min、インキュベート
↓
37℃、10min、インキュベート
↓
ハイブリバッグにmembraneを入れる
↓
LASで撮影
- 電気泳動-
10×MOPS 35ml
DW up to 350ml
ゲルの作製 ゲル(小) ゲル(大)
form aldehyde(37%) 1.1ml 1.65ml
1×MOPS 18.9ml 28.35ml
Agar 0.2g 0.3g
(Agarをレンジで溶かした後にform aldehydeを入れる)
sample RNAの調製
適量のtotalRNAを全量が10μl(15μl)になるようにDWでメスアップする
loading bufferの調製
formamide(100%) 250μl
formaldehyde(37%) 83μl
10×MOPS 50μl
50% glycerol 104.5μl
BPB(2%) 10μl
EtBr(10mg/ml) 2.5μl
(-20℃で保存可能)
Loading sampleの調製
Sample RNA 10μl(15μl)
Loading buffer 10μl(15μl)をmix
↓
65℃,10min
↓
氷冷
泳動
50V、60min泳動し、その後ゲルを写真撮影する
- ブロッティング-
↓
ブロッティング台を組み立てる
↓
over night Membrane:Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech社)
c40d1bbb3dc0fc6d.pdf
- ハイブリダイゼーション-
ブロッティング後、membraneを2×SSCで浸した濾紙に、ブロット面が上になるように乗せる (ゲルを写真撮影して、ブロッティングがうまくいったか確認する)
↓
UV cross linkする
↓
DWで軽くすすぐ
↓
dry up
↓ (DIG Easy Hyb: Roche)
ハイブリバッファー4mlを入れたハイブリ管(50℃で暖めておく)にmembraneを入れる
↓
50℃、30min以上プレハイブリダイゼーションを行う
プローブ調製
適量のDIG probeをDWで全量50μlにメスアップする
↓
95℃,5min
↓
氷冷
ハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーション後、membraneに直接かからないようにプローブ全量をハイブリバッファーに加える
↓
50℃、over night、ストリンジェンシーバッファー(低:2×SSC,0.1%SDS、高:0.2×SSC,0.1%SDS)を50℃に暖めておく
- シグナルの検出-
↓
50℃、15min洗う(二回)
↓
高ストリンジェンシーバッファーで、50℃、15min洗う(二回)
↓
Wash buffer*で室温、2min洗う
↓
blocking buffer*(約30ml)で室温、30min以上ブロッキングする
↓
抗体溶液(Anti-DIG-AP* 2μl / blocking buffer *20ml)で室温、30min、抗体反応
↓
Wash buffer*で室温、15min洗う(二回)
↓
Detection buffer*(19ml)で室温、3min洗う
↓
平らにしたパラフィルムの上にCSPD*(1ml)を乗せ、その上にmembraneをブロット面が下に気泡が入らないように置き、その上にパラフィルムでサンドする
↓
室温、5min、インキュベート
↓
37℃、10min、インキュベート
↓
ハイブリバッグにmembraneを入れる
↓
LASで撮影
はDIG Wash and Block Buffer Set(Dnase and RNase free)及びReady to use CSPD を使用
参照:Roche DIG Application Manual2006年04月03日(月) 10:47:57 Modified by applied_biology
添付ファイル一覧(全1件)
c40d1bbb3dc0fc6d.pdf (16.35KB)
Uploaded by applied_biology 2006年04月03日(月) 10:46:18
Uploaded by applied_biology 2006年04月03日(月) 10:46:18