RIプローブの作製
RIノーザン用プローブの作製（石崎）
A: PCRでプローブとしたい範囲のDNA断片を調製する
B: 32P-dCTPのラベルを入れる（32Pでラベルを入れたプローブは2-3週間で活性が低下するので、前もってノーザンやサザンの膜を作製しておく）
A: PCRでプローブとしたい範囲のDNA断片を調製する
準備物
PCR用の鋳型
（もしあればクローニングした断片の挿入されたベクター、なければゲノム）
増幅用プライマー上流、下流。
（500bp-1kbpの断片を増幅できるプライマーセットが良い。）
ExTaq
ExTaq buffer
dNTPmix
MilliQ水（autoclaved）
電気泳動用ゲル、バッファー
Qiagen PCR Purification Kit
手順
1. 常法に従って鋳型、プライマーなどを混合し、50μl一本のPCRを行う。
2. 5μlを電気泳動し、サイズが適切であることとバンドが1本であることを確認する。
3. 増幅効率が悪い場合やバンドが複数見られた場合はPCR条件を変更して再トライ。
4. 最適条件でさらにあと３本のPCRを行う。
5. Qiagen PCR Purification Kitの説明書を読む
6. ４本のPCR反応液を1本のエッペンチューブに集める
7. キットのバッファーPBをPCR反応液の五倍量加え、ピペッティングで混ぜる。
8. キットのカラムに入るだけ入れる
9. 遠心13000rpm 1min
10. フロースルーをすてる
11. 残っている７の液を再度カラムに入れる
12. 遠心13000rpm 1min
13. フロースルーをすてる
14. バッファーPEにエタノールが入っていることを確認
15. 700μlのバッファーPEをカラムに入れる
16. 遠心13000rpm 1min
17. フロースルーをすてる
18. 何も入れないで空遠心13000rpm 1min
19. カラムを新しいエッペンにのせる
20. 50μlのバッファーEBまたはMilliQ水（autoclaved）をカラムの真ん中にのせる
21. 1分静置
22. 遠心13000rpm 1min
23. 溶出液がBのラベリングに使用するプローブになる（カラムは捨てる）−２０℃保存
24. 溶出液中のDNA濃度をUVで測定する。20ng/μl以上ならOK
25. 溶出液の一部を電気泳動して純度と濃度を確かめる。
26. 皆で共通に使うので作製者名、作製日、プローブ名、濃度、サイズをエッペンに明記し、RI室の冷凍庫に入れておく
B: プローブに32P-dCTPのラベルを入れる
32Pでラベルを入れたプローブは2-3週間で活性が低下するので、前もってノーザンやサザンの膜を作製しておく
準備
32P-dCTP（冷凍庫から出して室温で溶かしておく）
RI室のヒートブロック2台（95℃と37℃にセット）
Aで作製したプローブ
Takaraのランダムプライムラベリングキット（RI室の冷凍庫）
手順
1. Aで作製したプローブからDNA約50ngをエッペンに入れる
2. MilliQ水（autoclaved）を加えて6μlにする
3. Takaraのキットのランダム９merを1μl加える
4. 95℃ ５min
5. on ice 5min
6. spin down
7. 1.25μlのx10 bufferを加える
8. 1.25μlのdNTP mixを加える
9. 2.5μlの32P-dCTPを加える
10. 0.5μlのKlenow fragment (酵素)を加える
11. 軽く混ぜてspin down
12. 37℃で30min-overnight インキュベート
13. spin down
14. QiagenキットのバッファーPNを250μl加え、ピペッティングで混ぜる
15. カラムに全量入れる
16. 6000rpm 1min遠心
17. カラムを新しいカップにのせる
18. バッファーPEを500μlカラムにのせる
19. 6000rpm 1min遠心
20. カラムを新しいカップにのせる
21. 空遠心13000rpm 1min
22. カラムを新しいエッペンにのせる
23. 101μlのバッファーEBをカラムの中央にのせる
24. 1分静置
25. 10000rpm 1min遠心
26. 溶出液をハイブリダイゼーションに用いるときまで鉛の容器に入れて-20℃で保存する。
27. カラムや廃液の後片付けをする。
A: PCRでプローブとしたい範囲のDNA断片を調製する
B: 32P-dCTPのラベルを入れる（32Pでラベルを入れたプローブは2-3週間で活性が低下するので、前もってノーザンやサザンの膜を作製しておく）
A: PCRでプローブとしたい範囲のDNA断片を調製する
準備物
PCR用の鋳型
（もしあればクローニングした断片の挿入されたベクター、なければゲノム）
増幅用プライマー上流、下流。
（500bp-1kbpの断片を増幅できるプライマーセットが良い。）
ExTaq
ExTaq buffer
dNTPmix
MilliQ水（autoclaved）
電気泳動用ゲル、バッファー
Qiagen PCR Purification Kit
手順
1. 常法に従って鋳型、プライマーなどを混合し、50μl一本のPCRを行う。
2. 5μlを電気泳動し、サイズが適切であることとバンドが1本であることを確認する。
3. 増幅効率が悪い場合やバンドが複数見られた場合はPCR条件を変更して再トライ。
4. 最適条件でさらにあと３本のPCRを行う。
5. Qiagen PCR Purification Kitの説明書を読む
6. ４本のPCR反応液を1本のエッペンチューブに集める
7. キットのバッファーPBをPCR反応液の五倍量加え、ピペッティングで混ぜる。
8. キットのカラムに入るだけ入れる
9. 遠心13000rpm 1min
10. フロースルーをすてる
11. 残っている７の液を再度カラムに入れる
12. 遠心13000rpm 1min
13. フロースルーをすてる
14. バッファーPEにエタノールが入っていることを確認
15. 700μlのバッファーPEをカラムに入れる
16. 遠心13000rpm 1min
17. フロースルーをすてる
18. 何も入れないで空遠心13000rpm 1min
19. カラムを新しいエッペンにのせる
20. 50μlのバッファーEBまたはMilliQ水（autoclaved）をカラムの真ん中にのせる
21. 1分静置
22. 遠心13000rpm 1min
23. 溶出液がBのラベリングに使用するプローブになる（カラムは捨てる）−２０℃保存
24. 溶出液中のDNA濃度をUVで測定する。20ng/μl以上ならOK
25. 溶出液の一部を電気泳動して純度と濃度を確かめる。
26. 皆で共通に使うので作製者名、作製日、プローブ名、濃度、サイズをエッペンに明記し、RI室の冷凍庫に入れておく
B: プローブに32P-dCTPのラベルを入れる
32Pでラベルを入れたプローブは2-3週間で活性が低下するので、前もってノーザンやサザンの膜を作製しておく
準備
32P-dCTP（冷凍庫から出して室温で溶かしておく）
RI室のヒートブロック2台（95℃と37℃にセット）
Aで作製したプローブ
Takaraのランダムプライムラベリングキット（RI室の冷凍庫）
- ランダム9mer（溶かして混ぜてスピンダウンしておく）
- x10バッファー（溶かして混ぜてスピンダウンしておく）
- dNTPmix（溶かして混ぜてスピンダウンしておく）
- Klenow fragment(大腸菌DNAポリメラーゼIの大サブユニット)
手順
1. Aで作製したプローブからDNA約50ngをエッペンに入れる
2. MilliQ水（autoclaved）を加えて6μlにする
3. Takaraのキットのランダム９merを1μl加える
4. 95℃ ５min
5. on ice 5min
6. spin down
7. 1.25μlのx10 bufferを加える
8. 1.25μlのdNTP mixを加える
9. 2.5μlの32P-dCTPを加える
10. 0.5μlのKlenow fragment (酵素)を加える
11. 軽く混ぜてspin down
12. 37℃で30min-overnight インキュベート
13. spin down
14. QiagenキットのバッファーPNを250μl加え、ピペッティングで混ぜる
15. カラムに全量入れる
16. 6000rpm 1min遠心
17. カラムを新しいカップにのせる
18. バッファーPEを500μlカラムにのせる
19. 6000rpm 1min遠心
20. カラムを新しいカップにのせる
21. 空遠心13000rpm 1min
22. カラムを新しいエッペンにのせる
23. 101μlのバッファーEBをカラムの中央にのせる
24. 1分静置
25. 10000rpm 1min遠心
26. 溶出液をハイブリダイゼーションに用いるときまで鉛の容器に入れて-20℃で保存する。
27. カラムや廃液の後片付けをする。
2006年04月03日(月) 23:30:09 Modified by applied_biology