ノーザンブロット解析プロトコル(DIG)mikioだよ

• 電気泳動-

泳動バッファーの作製(用時調製)
10×MOPS 35ml
DW up to 350ml

ゲルの作製　　　　　　ゲル(小)　　　ゲル(大)
form aldehyde(37%) 1.1ml 1.65ml
1×MOPS 18.9ml 28.35ml
Agar 0.2g 0.3g
(Agarをレンジで溶かした後にform aldehydeを入れる)

sample RNAの調製
適量のtotalRNAを全量が10μl(15μl)になるようにDWでメスアップする

loading bufferの調製
formamide(100%) 250μl
formaldehyde(37%) 83μl
10×MOPS 50μl
50% glycerol 104.5μl
BPB(2%) 10μl
EtBr(10mg/ml) 2.5μl
(-20℃で保存可能)

Loading sampleの調製
Sample RNA 10μl(15μl)
Loading buffer 10μl(15μl)をmix
　　　　↓
　　65℃,10min
　　　　↓
　　　氷冷

泳動
50V、60min泳動し、その後ゲルを写真撮影する

• ブロッティング-

ゲルを20×SSCで15min洗う(二回)
　　　　　　↓
ブロッティング台を組み立てる
　　　　　　↓
　　　　 over night Membrane:Hybond N+(Amersham Pharmacia Biotech社)
c40d1bbb3dc0fc6d.pdf

• ハイブリダイゼーション-

blotの固定〜プレハイブリダイゼーション
ブロッティング後、membraneを2×SSCで浸した濾紙に、ブロット面が上になるように乗せる (ゲルを写真撮影して、ブロッティングがうまくいったか確認する)
↓
UV cross linkする
↓
DWで軽くすすぐ
↓
dry up
↓　　　　　　(DIG Easy Hyb: Roche)
ハイブリバッファー4mlを入れたハイブリ管(50℃で暖めておく)にmembraneを入れる
↓
50℃、30min以上プレハイブリダイゼーションを行う

プローブ調製
適量のDIG probeをDWで全量50μlにメスアップする
↓
95℃,5min
↓
氷冷

ハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーション後、membraneに直接かからないようにプローブ全量をハイブリバッファーに加える
↓
50℃、over night、ストリンジェンシーバッファー(低：2×SSC,0.1%SDS、高：0.2×SSC,0.1%SDS)を50℃に暖めておく

• シグナルの検出-

membraneをハイブリ管から取り出し、暖めておいた低ストリンジェンシーバッファーを入れたタッパに入れる
↓
50℃、15min洗う(二回)
↓
高ストリンジェンシーバッファーで、50℃、15min洗う(二回)
↓
Wash buffer*で室温、2min洗う
↓
blocking buffer*(約30ml)で室温、30min以上ブロッキングする
↓
抗体溶液(Anti-DIG-AP* 2μl / blocking buffer *20ml)で室温、30min、抗体反応
↓
Wash buffer*で室温、15min洗う(二回)
↓
Detection buffer*(19ml)で室温、3min洗う
↓
平らにしたパラフィルムの上にCSPD*(1ml)を乗せ、その上にmembraneをブロット面が下に気泡が入らないように置き、その上にパラフィルムでサンドする
↓
室温、5min、インキュベート
↓
37℃、10min、インキュベート
↓
ハイブリバッグにmembraneを入れる
↓
LASで撮影

はDIG Wash and Block Buffer Set(Dnase and RNase free)及びReady to use CSPD を使用

参照：Roche DIG Application Manual