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チュートリアル:Cytoscapeでの基本的な発現解析−ヒト

スライドショー Basic Expression Analysis in Cytoscape (30 分)
ハンドアウト Basic_Expression_Analysis_in_Cytoscape-Human.pdf (11 ページ)

チュートリアルのキュレーター Kristina Hanspers, Alex Pico, Mike Smoot
目次
1 ネットワークの読み込み
2 発現データの読み込み
3 発現データの可視化
3.1 ノード色の設定
3.2 デフォルトのノード色の設定
3.3 ノードの形の設定
3.4 ノードの境界の設定
4 データ解析機能
4.1 ノードのフィルター
4.2 ノードの検索
4.3 ノードの探索

3.3 ノードの形の設定 〜 3.4 ノードの境界の設定が訳者の環境では反映されず。設定ミスの可能性が高くあとで見直します。

Cytoscapeはオープンソースソフトウエアなプラットフォームであり、ネットワークの情報付加、可視化、解析を行うものです。このチュートリアルでは以下を紹介します:
  • 異なるソースからのデータの結合:マイクロアレイ発現データからの実験値と相互作用データ形式でのネットワークデータ。
  • 発現データを用いたネットワークの可視化。
  • 発現データに基づくネットワークのフィルタリング。

ネットワークの読み込み

  • Cytoscapeを開始しFile:HumanInteractome subset.sifネットワークを読み込みます。
  • force-directedレイアウトを適用しノードのレイアウトを組織化します。"Layout->Cytoscape Layouts->Force-Directed Layout"メニューを選択します。
  • ネットワークはこのようになります:

発現データの読み込み

  • 発現データFile:Pellegrini et al Data.txt.zipをダウンロードしunzip展開をします。
  • 手持ちのテキストエディタでPellegrini_et_al_Data.txtファイルを開いてみてください。最初の数行は以下のとおりとなっています:
Gene Symbol Entrez id Probeset CREB kd control p value fold change Sign CREB binding
A2M 2 217757_at 42.24 57.45 0.4 1.5 yes
A2ML1 144568 1553505_at 67.95 206.47 0.11 0.58
A2ML1 144568 1564307_a_at 160.05 183.44 0.81 0.95
このファイルについて以下の情報を確認してください:
  1. 最初の行はラベルからなります。
  2. すべての列は1つのTABで区切られています。
  3. 最初の列はノード名であり、ネットワークのノード名と正確に一致する必要があります!
  4. 2列目はEntrez Gene IDです。
  5. 3列名はAffymetrix probe set IDです。この列はオプションであり、現在はCytoscapeでは使われていませんが他のマイクロアレイ解析ツールでの解析では有用です。
  6. のこりの列は実験値です;実験の平均発現値、コントロール集団の平均発現値、比較のp値と倍率変化、CREBデータビンによるよらないに関わらずこうなっています。データ生成の詳細についてはmanuscriptを参照のこと。
注意: この例で用いられる発現データは相互作用ネットワークに関して前処理が行われているものです。このデータはPellegrini et al, BMC Cancer, 2008のデータからなっています。
  • Fileメニューから、Import → Attribute from Table (Text/MS Excel)を選択します。
  • 属性のタイプで"Node"をクリック(訳注:デフォルト値)します。
  • Pellegrini_et_al_Data.txtファイルを選択します。
  • "Text File Import Options"(訳注:Show Text File Import Options)チェックボックスをクリックします。
  • "Delimiter"セクションで"Tab"チェックボックスがチェックされていることと、"Delimiter"内の他のチェックボックスがチェックされていないことを確認します。プリビューにデータの複数の列が表示されています。
  • "Attribute Names"セクションの"Transfer first line as attribute names"チェックボックスをクリックします。プリビューにて最初の行が列名となっています。
  • "Import"ボタンをクリックして属性データを読み込みます。

ここでNode Attribute Browserを使い以下のように発現データを閲覧します。
  • Cytoscape canvas上でノードをクリックして選択します。
  • Node Attribute BrowserにてSelect Attributesボタンをクリックし、左クリックによって属性"fold change"と"p value"を選択します。右クリックでメニューは閉じます。
  • Node Attribute Browserにて発現値に関してノードがリストされ、このようになります。

発現データの可視化

Cytoscapeでの発現データの一般的な使われ方は、発現データに関するネットワーク上でのノードのビジュアルな属性を設定することでしょう。これにより強力な可視化、機能的関連の表現、実験的な反応を同時に表すことができます。ここで、これらを順を追って見ていきましょう。

ノード色の設定

  • Visual Mapping Browser内のUnused Visual PropertiesセクションにあるNode Colorをダブルクリックします。
  • これによりNode ColorVisual Mapping Browserのトップに移動します。
  • Node Colorセクションの"Please select a value!"をクリックします。
  • 利用出来る属性名がドロップダウンメニューで示されます。"fold change"を選択します。
  • Node Colorセクションの"Please select a mapping"をクリックします。
  • 利用可能なマッピングタイプがドロップダウンメニューで示されます。"Continuous Mapping"を選択します。
  • これにより黒から白への基本的な色の階調が示されます。
  • 色を変えるために色の階調をクリックします。これにより階調編集のダイアログポップアップが表示されます。
  • 低い境界値の色を変えるために左端の黒い三角をダブルクリックします。明るい赤を選択します。
  • 続けて2番目の黒い三角を0.5に近い値までスライドさせます。これにより赤から白までの階調になります。(訳注:先のように赤から白にするには、この三角もダブルクリックして明るい赤を選択する必要あり)
  • 左端(訳注:右端から2番目のはず)の白い三角をスライドさせて1に近づけます。
  • Addボタンをクリックして新しく白い三角を追加します。
  • 新しく追加した三角をダブルクリックして明るい緑を選択します。この三角をスライドさせて2に近づけます。
  • 一番右端の白い三角をダブルクリックして同じ明るい緑を選択します。
  • これにより、赤-白-緑の色の階調が下記のように表示されます。
  • 階調調整ダイアログを閉じて、新しい色のスキームでネットワーク上のノードが色付けされたことを確認してください。

デフォルトのノード色の設定

デフォルトのノード色のピンクがこのスペクトルから抜け落ちていることに注意してください。よく使われる手段として発現が定義されない値はスペクトルから区別した色を用いることがあります。
  • VizMapperパネルのDefaultsネットワークアイコンをクリックします。
  • Node Color(訳注:NODE_FILL_COLOR)エントリで暗い灰色を選択します。
  • ネットワークビューにてズームアウトしていくつかのノードが灰色になっていることを確認してください。

ノードの形の設定

(訳注:訳者の環境ではノードの形の設定が反映されず、、、)
CREB kbとコントロール細胞間の比較である倍率変化値とp値の両方を読み込んでいます。ここでp値をノードの形で示しましょう。信頼性が高いものを四角、低いものを円とします。
  • Visual Mapping BrowserUnused Visual Properties(訳注:Unused Properties)セクション内のNode Shapeをダブルクリックします。
  • これによりNode ShapeVisual Mapping Browserのトップに移動します。
  • Node Shapeセクションの"Please select a value!"をクリックします。
  • これにより利用可能な属性名がドロップダウンメニューで表示されます。"p value"を選択します。
  • Node Shapeセクションの"Please select a mapping"(訳注:"Please select mapping type")をクリックします。
  • これにより利用可能なタイプがドロップダウンメニューで表示されます。"Continuous Mapping"を選択します。
  • これによりNode Shapeセクションの"Graphical View"に空のアイコンが作成されます。このアイコンをクリックします。
  • continuous shape selection(訳注:Continuous Editor for Node Shape)ダイアログが開きます。
  • Addボタンをクリックします。
  • これによりスライダーが領域を半分に分け、スライダーの両側にノードの形のアイコンが表示されます。
  • 左側のノードアイコン(円形)をダブルクリックします。
  • これによりノードの形を選択するポップアップが開きます。
  • Rectangleを選択してApplyボタンをクリックします。
  • continuous shape selection(訳注:Continuous Editor for Node Shape)ダイアログに四角と円形のノードの形のアイコンが表示されています。
  • 黒い三角クリックして左に移動させ、0.5よりやや小さくします。これを信頼性の閾値とします。
  • continuous shape selection(訳注:Continuous Editor for Node Shape)ダイアログを閉じて、いくつかのノードの形が四角に別のノードが円形になったことを確認してください。

ノードの境界の設定

(訳注:訳者の環境ではノードの境界の設定が反映されず、、、)
ノードの境界色とスタイルも使うことができ、CREB(文献)による有意な閾値を超えたノードかどうかを示すことができます。このデータは既に属性としてデータセット内で利用可能となっています。
  • Visual Mapping BrowserUnused Visual PropertiesセクションのNode Border Colorをダブルクリックします。
  • これによりVisual Mapping BrowserのトップにNode Border Colorが移動します。
  • Node Border Colorセクションの"Please select a value!"をクリックします。
  • 利用可能な属性名がドロップダウンメニューに表示されます。"Sign CREB binding"を選択します。
  • 利用可能なマッピングタイプがドロップダウンメニューに表示されます。"Discrete Mapping"を選択します。
  • 新しい行ができ値は"yes"となっています。この属性ではこの値のみが利用可能です。"yes"の右の空欄をクリックし、現れた四角いアイコン(訳注:"..."と表示されたボタン)をクリックします。
  • 色選択画面が現れます。色のスキーム(訳注:ノードの色)に対して目立つ色を選択します。この例では明るい黄色を選択します。ネットワーク上の関連するノードが黄色く縁どられます。
次に、境界の太さを変えてみましょう。細い黄色い境界は見えにくくなります。
  • Visual Mapping BrowserUnused Visual PropertiesセクションのNode Line Widthをダブルクリックします。
  • これによりVisual Mapping BrowserのトップにNode Line Widthが移動します。
  • Node Line Widthセクションの"Please select a value!"をクリックします。
  • 利用可能な属性名がドロップダウンメニューに表示されます。"Sign CREB binding"を選択します。
  • 利用可能なマッピングタイプがドロップダウンメニューに表示されます。"Discrete Mapping"を選択します。
  • 新しい行ができ値は"yes"となっています。この属性ではこの値のみが利用可能です。デフォルトの境界の太さは1.5となっています。
  • その欄をクリックし、5と入力します。
  • ネットワークの一部にズームインすると以下のようになっているでしょう:

データ解析機能

このセクションではCytoscapeの機能の例をいくつか紹介します。これはネットワークと関連するデータを解析するものです。
最初に、いくつか元となるデータが必要です。ヒトの骨髄性白血病細胞株の実験データです。cAMP応答配列結合タンパクであるCREBはshRNAによりノックダウンされノックダウン細胞の発現プロファイルは同じ細胞株のコントロール細胞と比較されています。Pellegrini et al参照。

ノードのフィルター

ノードかエッジの属性のどちらかに基づいてCytoscape上のネットワークはフィルター掛けすることができます。ここで、2群間での倍率変化の強弱に基づいたネットワークのフィルタ掛けを行います。
  • Control Panel内のFiltersタブをクリックします。
  • Filter Definition内のAttribute/Filterで"node.fold change"をクリックします。
  • Filter DefinitionセクションのAddボタンをクリックし、選択した属性をフィルターに追加します。
  • これにより、フィルターに倍率変化についてのスライダーが作成されます。
  • スライダーをダブルクリックしてカットオフ値を選択します。low boundに2を入力してOKをクリックします。
  • ここで、選択したノードのすぐ隣りのノードを選択するためにSelect → Nodes → First Neighbors of Selected Nodesを選択します。
  • 新しいネットワークを作成するために、New → Network → From Selected Nodes, All Edgesを選択します。
  • force-directedレイアウトを新しいネットワークに適用するためにLayout → Cytoscape Layouts → Force-Directed Layoutを選択します。
  • Control PanelNetworkを指定します。新しいネットワーク名を編集するために、ネットワーク名を右クリックしてEdit Network Titleを選択します。"upregulated"と入力します。
  • 新しいネットワークはこのようになるでしょう:
  • Repeat the Filter for down-regulated遺伝子に関してフィルター掛けを繰り返し、倍率変化を0.5未満とします。2つ目のサブネットワークに"downregulated"と名前を付けます。
  • "downregulated"ネットワークはこのようになるでしょう:

ノードの検索

ここで、ネットワークからCREB1 (CREB)ノードを検索してみましょう。
  • ツールバーにて、Search boxの右の、Configure search optionsアイコンをクリックします.
  • 開いたダイアログにて、ラジオボタンはNodesを選択し(訳注:デフォルト)、ドロップダウンメニューでUnique Identifierを選択します(訳注:デフォルト)。Applyボタンをクリックします。
  • 検索フィールドに、"CREB"と入力します。ヒットしたリストが生成され、CREB1と名付けられたノードが見つかります。これはCREB transcription factorのエイリアスです。リストからこのノードをを選択し、Enterを押します。
  • ネットワーク上のCREBノードがハイライトされます。
  • CREBの周りの相互作用を探索するのを簡単にするために、CREBの近隣のネットワークを新たに作成することができます。Select → Nodes → First Neighbors of Selected Nodesを選択します。
  • ノードのセットがハイライトされます。File → New → Network → From Selected Nodes, All Edgesを選択します。新しいネットワークが生成されます。
  • force-directed レイアウトを適用してネットワークを綺麗にします。
  • ネットワークは下記のようになります:
  • ネットワークを検証することにより、CREBがアップレギュレートかダウンレギュレートのノードと相互作用しているかを見ることができます。CREBは転写抑制と転写活性の両方に働くと知られています。もしアップレギュレートとダウンレギュレートのノードをそれぞれ含むサブネットワークでCREBを検索すれば、両方のネットワークにCREBが存在することがわかるでしょう。

ノードの探索

  • "HumanInteractome_subset"ネットワークにて、CREB1ノードを右クリックします。
  • LinkOut → Entrez → Geneメニューを選択します。
  • これによりポップアップブラウザウィンドウが開き、CREBについてのEntrez Geneデータベース画面が見られます。

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